Expression of an Indolicidin Analogue in Pichia Pastoris
Author
Castberg, Stig
Term
4. term
Education
Publication year
2009
Abstract
Antimicrobial peptides (AMPs) are promising candidates for new antibiotics, yet they can be challenging to produce. This thesis explores the expression and characterization of a single-tryptophan indolicidin analogue, IL4 (ILPWKLPLLPLRR), in the yeast host Pichia pastoris with an emphasis on secretion into the medium. A pPICZαA/IL4 vector was constructed and linearized with SacI, P. pastoris was transformed by electroporation, and recombinant IL4 was produced and secreted. For comparison, IL4 was also chemically synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS). Both recombinant and synthetic IL4 were purified by size exclusion chromatography and analyzed by MALDI-TOF MS and LC-ECI MS/MS. The antimicrobial activity of the synthesized IL4 and two commercial detergents was evaluated by disk diffusion assays against Gram-positive Bacillus subtilis and Gram-negative Pseudomonas putida. The excerpt documents production and secretion of recombinant IL4 and the completion of purification, analytical characterization, and activity testing; specific yields and activity outcomes are not provided in the available text.
Antimikrobielle peptider (AMPs) er lovende som nye antibiotika, men deres produktion kan være udfordrende. Dette speciale undersøger udtryk og karakterisering af en enkelt-tryptofan-analog til indolicidin, IL4 (ILPWKLPLLPLRR), i gærværten Pichia pastoris med fokus på sekretion til mediet. En pPICZαA/IL4-vektor blev konstrueret og lineæriseret med SacI, hvorefter P. pastoris blev transformeret ved elektroporation. Rekombinant IL4 blev produceret og secerneret til mediet. Som sammenligningsgrundlag blev IL4 også syntetiseret kemisk ved fastfase-peptidsyntese (SPPS). Både rekombinant og syntetisk IL4 blev renset ved størrelseseksklusionskromatografi og analyseret med MALDI-TOF MS og LC-ECI MS/MS. Den antimikrobielle aktivitet af det syntetiske IL4 og to kommercielle detergenter blev testet ved disk-diffusionsforsøg mod gram-positiv Bacillus subtilis og gram-negativ Pseudomonas putida. Uddraget dokumenterer produktion og sekretion af rekombinant IL4 samt udførelsen af oprensning, karakterisering og aktivitetsforsøg; specifikke udbytter og aktivitetsresultater fremgår ikke af den tilgængelige tekst.
[This apstract has been generated with the help of AI directly from the project full text]
Keywords