Development of a molecular toolbox for the oleaginous yeast Cutaneotrichosporon oleaginosus
Author
Gamberoni, Mattia
Term
4. semester
Publication year
2023
Submitted on
2023-05-24
Abstract
Oleaginøse gærsvampe er lovende cellefabrikker til biobrændstoffer og andre værdistoffer, og Cutaneotrichosporon oleaginosus skiller sig ud ved at akkumulere store mængder lipider og tåle almindelige fermenteringshæmmere. Genetisk manipulation af arten er dog vanskelig på grund af en tyk cellevæg og en præference for ikke-homolog endesammenføjning, og der mangler let anvendelige værktøjer. Dette speciale havde til formål at opbygge en enkel, reproducerbar molekylær værktøjskasse for C. oleaginosus ved at udvikle en elektroporationsbaseret transformationsprotokol og et system til genbrug af selektionsmarkører. En elektroporationsprocedure med selektion på nourseothricin og hygromycin B, suppleret med cefoxitin for at dæmpe baggrundsvækst, blev etableret, og lineære DNA-fragmenter på over 9 kb blev introduceret som tilfældige genomiske integrationer. Protokollen blev dernæst brugt til at konstruere en stamme med et tetracyklin-inducerbart TetON Cre-Lox-modul, der sigter mod at fjerne nourseothricin-markøren og muliggøre gentagne transformationer med samme selektion. For at verificere integration og markørfjernelse blev der udført helgenomsekventering. Resultaterne var imidlertid ikke entydige, da de analyserede prøver viste sig at være Yarrowia lipolytica og ikke C. oleaginosus, uden påvist integration, hvilket peger på et utilsigtet prøveskift. På den baggrund præsenterer specialet en praktisk ramme for transformation og markørgenbrug, men den endelige effektivitet i C. oleaginosus kræver yderligere validering, som på sigt kan bane vejen for mere avanceret genome-redigering og stofskifteengineering i denne robuste gær.
Oleaginous yeasts are promising cell factories for biofuels and other valuable products, and Cutaneotrichosporon oleaginosus stands out for its high lipid accumulation and tolerance to common fermentation inhibitors. However, genetic engineering of this species is hindered by a thick cell wall and a bias toward non-homologous end joining, and practical tools are scarce. This thesis set out to build a simple, reproducible molecular toolbox for C. oleaginosus by developing an electroporation-based transformation protocol and a system for recycling selection markers. An electroporation workflow using nourseothricin and hygromycin B selection, supplemented with cefoxitin to suppress background growth, was established, and linear DNA fragments exceeding 9 kb were introduced as random genomic insertions. The protocol was then used to construct a strain carrying a tetracycline-inducible TetON Cre-Lox module intended to excise the nourseothricin marker and enable iterative transformations with the same selection. Whole-genome sequencing was performed to verify integration and marker excision. The results were inconclusive, as the analyzed isolates proved to be Yarrowia lipolytica rather than C. oleaginosus, with no integrations detected, suggesting an accidental sample swap. Thus, the thesis presents a practical framework for transformation and marker recycling, but its effectiveness in C. oleaginosus remains to be validated, which would ultimately enable more advanced genome editing and pathway engineering in this robust yeast.
[This summary has been generated with the help of AI directly from the project (PDF)]
Documents