The effect of antimicrobial peptide indolicidin and its analogues on human embryonic stem cells

Effekten af det antimikrobielle peptid indolicidin og dets analoger på menneske embryoniske stamceller

Klausen, Lasse Hyldgaard

4. term

Nanotechnology, Master

2012

2012-06-15

100

Menneskelige embryonale stamceller kan forny sig selv og udvikle sig til enhver celletype i den voksne krop, men dyrkning i laboratoriet kræver stram kontrol. En nyligt påpeget forskel ved disse celler er DNA-basen 5-hydroxymethylcytosin (5hmC), som i pattedyrsceller næsten kun findes i embryonale stamceller. Vi undersøgte, om indolicidin (et antimikrobielt peptid, der binder DNA og kan blokere bakteriers DNA-syntese) og beslægtede peptider kan trænge ind i embryonale stamceller, binde deres DNA (eventuelt ved 5hmC) og påvirke cellernes tilstand. Vi testede indolicidin, et analogt peptid (indolicidin-4) og en ny fluorescerende variant (IL4-RWT, mærket med rhodamin WT) på to linjer af humane embryonale stamceller (RH1 og T8), dyrket på Matrigel i mTeSR-medium. Vi fastlagde cytotoksiske koncentrationer og fulgte peptidoptagelsen. Flowcytometri viste en langsom, lineær stigning i det intracellulære signal i overensstemmelse med endocytose, hvilket blev underbygget af konfokal laserscannings-fluorescensmikroskopi, der viste inklusionslegemer. Derefter vurderede vi, om IL4 påvirkede pluripotens (cellernes evne til at blive til alle celletyper). I et kort forsøg med RH1 overvågede vi morfologi og målte udtrykket af Oct-4 og Nanog med real-time RT-PCR; der sås ingen signifikante ændringer. Et længere forsøg i T8-celler med indolicidin (IL) og IL4 indikerede en positiv effekt af IL4, men karyotypering afslørede kromosomal mosaik, hvilket gjorde resultaterne ugyldige. For at teste DNA-binding direkte isolerede vi DNA fra voksne HDF-celler og fra RH1-celler, fragmenterede det ved ultrasonikering eller enzymatisk fordøjelse og afbildede individuelle molekyler med atomkraftmikroskopi (AFM). Ultrasonikering gav fragmenter i den ønskede størrelse uden ekstra oprensning og blev valgt til peptid–DNA-forsøg. IL4 bandt DNA fra både HDF og RH1, og vi beskriver en hurtig, enkel arbejdsgang til visualisering og analyse af DNA-molekyler med AFM. Resultaterne viser, at et indolicidin-afledt peptid kan trænge ind i humane embryonale stamceller og binde DNA, mens effekten på pluripotens er uafklaret. Arbejdet leverer også en enkel metode til forberedelse og afbildning af DNA, som kan bruges i fremtidige studier af peptid–DNA-interaktioner.

Human embryonic stem cells can self-renew and develop into any adult cell type, but growing them in the lab requires tight control. One recently noted difference in these cells is the DNA base 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which is largely absent from most other mammalian cells. We explored whether indolicidin—an antimicrobial peptide that binds DNA and blocks bacterial DNA synthesis—and related peptides might enter embryonic stem cells, bind their DNA (potentially at 5hmC), and influence cell state. We tested indolicidin, an analogue (indolicidin-4), and a new fluorescent version (IL4-RWT, labeled with rhodamine WT) on two human embryonic stem cell lines (RH1 and T8) grown on Matrigel in mTeSR medium. We established cytotoxicity thresholds and tracked peptide uptake. Flow cytometry showed a slow, linear increase in intracellular signal consistent with endocytosis, which confocal laser scanning fluorescence microscopy supported by revealing inclusion bodies. We next assessed whether the IL4 peptide affected pluripotency (the ability to become any cell type). In a short assay with RH1 cells, we monitored cell morphology and measured Oct-4 and Nanog expression by real-time RT-PCR; no significant changes were detected. A longer assay in T8 cells with indolicidin (IL) and IL4 suggested a positive effect for IL4, but karyotyping uncovered chromosomal mosaicism, invalidating those results. To test DNA binding directly, we isolated DNA from adult HDF cells and from RH1 cells, fragmented it by ultrasonication or enzymatic digestion, and imaged individual molecules by atomic force microscopy (AFM). Ultrasonication yielded fragments of the desired size without extra cleanup and was adopted for peptide–DNA tests. IL4 bound DNA from both HDF and RH1, and we outline a fast, straightforward workflow for visualizing and analyzing DNA molecules by AFM. These findings show that an indolicidin-derived peptide can enter human embryonic stem cells and bind DNA, while its impact on pluripotency remains unresolved. The work also provides a simple DNA preparation and imaging method useful for future peptide–DNA studies.

[This abstract was generated with the help of AI]

Nanotechnology ; nanobiotechnology ; stem cells ; embryonic ; human ; differentiation ; AMP ; antimicrobial ; indolicidin ; IL-4 ; rhodamine ; qPCR ; real time ; PCR ; reverse transcription ; flow cytometry ; nano ; FACS ; AFM ; atomic ; force ; microscopy ; sonication ; fragmentation ; DNA

Download
View record in AAU Student Projects