Extracellular DNA i renkulturer

Student thesis: Master thesis (including HD thesis)

  • Rasmus Clemmensen
DNA har tidligere været betragtet som et udelukkende intracellulært materiale til lagring af genetisk information, men siden opdagelsen af ekstracellulært DNA har man været nødt til at revidere denne opfattelse. Ekstracellulært DNA har mange andre funktioner end lagring af genetisk information, eksempelvis i stabilisering af biofilm struktur, beskyttelse af bakterien mod fremmed DNA og som næringsstof for bakterierne i sulteperioder osv. Hidtil har produktionen af eDNA primært været undersøgt i biofilm, men i dette projekt fokuseres der i højere grad på eDNA fra renkulturer af Thermotoga neapolitana, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Tsukamurella spumae og Bacillus mycoides samt fra komplekse prøver fra sten i to forskellige åer. Forsøgene der er blevet udført i forbindelse med dette specialeprojekt er opdelt i tre dele hvoraf den første består af eksperimenter på den termofile bakterie T. neapolitana. Den anden del indeholder eksperimenter på renkulturer og biofilm af P. aeruginosa, S. aureus, T. spumae og B. mycoides. Den tredje del omhandler eksperimenter på de komplekse prøver fra åer som nævnt overfor. Udviklingen og tilstedeværelsen af eDNA i de undersøgte prøver blev bekræftet ved hjælp af en visuel samt en genetisk fremgangsmåde. Det blev fundet at produktionen af eDNA i renkulturer var varierende og afhængig af kulturens vækstfase og sandsynligvis også forskellige stressfaktorer. Det fundne eDNA blev sammenlignet med genomisk DNA ekstraheret fra de samme kulturer ud fra fraktionsmønstre ved brug af restriktionsenzymerne HaeIII og MspI. Resultaterne fra disse forsøg var ikke fyldestgørende idet det genomiske DNA fra bakterierne desværre ikke var muligt at detektere hvilket gjorde en sammenligning umulig. En anden metode til at sammenligne eDNA og genomisk DNA blev prøvet, hvor Dnase I og ethidium momoazidbromid (EMA) blev brugt til henholdsvis at nedbryde og blokere eDNA således, at det genomiske DNA, som blev frigjort når cellerne blev lyseret, var den eneste tilgængelige DNA-type. Denne metode gav lovende resultater, selvom det ikke var muligt at amplificere genomisk DNA i alle tilfælde. Det genomiske DNA blev også sammenlignet med eDNA ud fra tilstedeværelsen af tre forskellige ”housekeeping” gener (16S rRNA, gyrB and rpoB) og ikke alle primerne gav det forventede bånd for de fire undersøgte bakterietyper. Generelt blev det dog observeret at bånd på agarose geler fra eDNA var klarere end bånd fra det genomiske DNA. Da polymerase kædereaktion (PCR) produkterne fra eDNA indeholdte samme genetiske information som det, der blev fundet for genomisk DNA, er det sandsynligt at eDNA er en kopi af det genomiske DNA.
LanguageEnglish
Publication date2009
Number of pages68
Publishing institutionAAU
ID: 18832318