Udvikling af et Nyt Peptid Baseret Probe til Billeddannelse af Tumorer

Student thesis: Master thesis (including HD thesis)

  • Tue Bennike
4. term, Nanotechnology, Master (Master Programme)
Til diagnosticering og behandling af kræft bliver radioaktive stoffer ofte anvendt. Opdagelsen af ændret receptor udtrykkelse i forbindelse med mange typer af kræft, har muliggjort udviklingen af receptor-målrettede stoffer ved at bruge radioaktivt mærkede peptider med selektiv receptor affinitet. Den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) er involveret i cellevækst og differentiering. Selvom EGFR ikke er tumor specifik, er den ofte overudtrykt i mange former for kræft, og overekspressionen af EGFR korrelerer med dårlig tilbagefald- og overlevelsesrate. Derfor udgør EGFR et potentielt mål for kræft diagnose og terapi, og for de ovennævnte anførte grunde blev receptoren valgt som mål i dette projekt. Det naturlige ligand for EGFR, den epidermal vækstfaktor (EGF), har stærk mitogenisk aktivitet, hvilket gør den til et dårligt valg i EGFR målrettet medicin. Derfor blev GE11, et EGF peptid analog, udvalgt til at undersøge muligheden for et EGFR målrettet affinitets peptid.
GE11 blev syntetiseret med fast fase peptid syntese og forgæves forsøgt fluorescens mærket med fluoroforen fluorescein (som fri syre). GE11 blev efterfølgende mærket med 5(6)carboxyfluorescein. Den korrekte vægt og aminosyre rækkefølge af mærket GE11 blev eftervist med massespektrometri teknikker. Forsøg på at oprense produktet voldt imidlertid problemer, og der blev påvist tegn på nedbrydningen af peptidet. Protokollen til syntesen blev optimeret, GE11 med lysin indsat i N-terminalen blev syntetiseret med et højere udbytte, og lysin-GE11 blev mærket med 5(6)carboxyfluorescein. Det fluorescerende stof blev afprøvet in vitro med fire forskellige varianter af den schweiziske 3T3 murine fibroblast cellelinje, NR6. NR6 har ingen endogen EGFR udtrykkelse, og er blevet stabilt transfekteret med cDNA, kodende for den fulde humane-EGFR eller mutanten EGFRvIII. Linjerne udtrykker derved enten fysiologiske niveauer af EGFR, over-udtrykker EGFR eller udtrykker den afkortede, kræft specifikke og konstitutivt aktive EGFRvIII. Udtrykkelsen af receptorerne blev delvist bekræftet med immunfluorescens, med to forskellige antistoffer, og analyseres med fluorescens mikroskopi og fluorescens konfokal laser skannende mikroskopi. Cellelinjer blev inkuberet i medium, indeholdende det syntetiserede fluorescens-mærkede stof, og internaliseringen af stoffet blev analyseret ved fluorescens mikroskopi. Affiniteten var imidlertid dårlig, da cellelinjerne med højeste intensitet blev fundet til at være de EGFRvIII- og fysiologiske EGFR udtrykkende. Disse resultater blev bekræftet af flow-cytometri analyse. Flow-cytometri analysen viste imidlertid også, i modsætning til fluorescens mikroskopi, at den laveste intensitet var af den EGFRvIII udtrykkende cellelinje. Lysin-GE11 med det kelatdannende DOTA bundet til N-terminalen blev syntetiseret og oprenset, for at teste peptidet in vivo ved hjælp af PET/CT-scannere. Stoffets evne til at danne komplekser med stabile gallium og fluorescerende europium blev verificeret, men da affiniteten af det fluorescerende peptid for EGFR var lav, og på grund af begrænset tid i projektet, blev metal DOTA-Lysin-GE11 komplekset ikke testet in vivo.
Det blev konkluderet, at den dårligt affinitet af lysin-GE11 for EGFR sandsynligvis skyldes den ekstra aminosyre lysin. Fremtidige projekter kunne undersøge GE11, eller andre peptider f.eks med affinitet for den kræft-specifikke EFGRvIII receptor, for at fortsætte udvikling af affinitets lægemidler til diagnostik og behandling af kræft.
LanguageEnglish
Publication date7 Jun 2011
Number of pages92
ID: 52848918