Udvikling af metoder til on-site DNA sekventeringdvilking

Studenteropgave: Speciale (inkl. HD afgangsprojekt)

  • Peter Rendbæk
4. semester, Bioteknologi, Kandidat (Kandidatuddannelse)
Effektiviteten af spildevandsrensningsanlæg er i høj grad bestemt af deres mikrobielle sammensætning. Derfor er identifikation af det mikrobielle samfund en vigtig del af at køre et bestemt spildevandsrensningsanlæg og forstå, hvordan det fungerer. I øjeblikket gøres dette i højt specialiserede laboratorier, men det begrænser metoden til at se tilbage ved ændringer og bruges ikke til at styre operationelle beslutninger. Imidlertid gøres der løbende fremskridt med sekventeringsteknologi (Oxford Nanopore Minion) og automatiseret prøveforberedelse gør det teoretisk muligt at flytte sekventering ud af laboratoriet. Men for at gøre dette til en realitet er der et behov for en hurtig, billig, pålidelig og meget mobil DNA-ekstraktion, der fungerer i lighed med State-of-the-art ekstraktionsmetoder.

I denne afhandling er der udviklet en brugervenlig, hurtig og meget mobil DNA-ekstraktionsmetode. Metoden er baseret på et kraftværktøj med en 3D-trykt adapter til bead beating baseret lysering af celler, og DNA isoleres ved anvendelse af fastfase-reversible immobiliseringsbeads
. Metoden blev sammenlignet med den nyeste og anbefalede DNA-ekstraktionsmetode for feltet af aktiveret slam-MiDAS-feltguide. Sammenligningen af fremgangsmåderne blev lavet på flere niveauer, inklusive mængden af ekstraheret DNA, renhed og fragmentering. Desuden blev 16S rRNA amplicon-sekventering brugt til at evaluere enhver potentiel ekstraktionsforstyrrelse i det observerede mikrobielle samfund.

Det blev vist, at den foreslåede DNA-ekstraktionsmetode ikke introducerede en bias i mikrobielle samfunds sammensætning og præsterede lige så godt på udbytte og renhed. Tilsvarende reduceres den samlede tid til DNA-extraction ned til ca. 10 minutter sammenlignet med 1-timers standard protokollen.

Der er dog behov for yderligere optimering for at sikre, at metoden opfylder kravet om høj renhed og lang DNA-fragmentlængde for MinION. Samlet set giver den udviklede tilgang et fundament for at flytte DNA-ekstraktionen og sekventeringen ud af laboratoriet og ind i feltet.
SprogEngelsk
Udgivelsesdato5 jun. 2017
Antal sider76
ID: 259181974