Expression and Investigation of RFP-GFP Fusion Protein

Studenteropgave: Speciale (inkl. HD afgangsprojekt)

  • Rasmus Utoft
  • Michael Nissen
4. semester, Nanoteknologi, Kandidat (Kandidatuddannelse)
I dette kandidat speciale forsøgte vi at konstruere og udtrykke et TagRFP-T-Linker-GFP S65T fusion
protein. Dette var forgæves. I stedet blev TagRFP-TagGFP fusion protein genes overført fra pCasper3-
GR til en pET11a vector ved hjælp af PCR. pCasper3 blev udtrykt i E. coli BL21(DE3). Fusionsproteinet
blev analyseret med SDS-PAGE, fluorescens spektroskopi og absorptions spektroskopi. SDS-PAGE viste
at et protein med den rigtige størrelse blev udtrykt. Absorptions spektroskopi viste maksima tæt på
dem for TagGFP og TagRFP. Fluorescens spektroskopi viste at FRET var ansvarlig for fluorescensen fra
TagRFP når TagGFP blev eksiteret. Temperatur skannings fluorescens spektroskopi blev brugt til at finde
smelte temperaturen for TagGFP. Den blev målt til at være 78 ◦. Smeltetemperaturen for TagRFP blev
målt til at være mindst 78 ◦. Homologi modellering blev brugt til at finde strukturen af fusionsproteinet.
Modelleringen viste at fusionsproteinet bestod af to β-barrels forbundet af en α-helix linker. Afstanden
mellem chromoforene blev målt til at være 5 nm. Yderligere studier af linkeren antydede at linkene bestod
af en random coil struktur, og at afstanden mellem chromoforene var længere end 5 nm.
SpecialiseringsretningNanobioteknologi
SprogEngelsk
Udgivelsesdato15 sep. 2015
Antal sider107
ID: 218879063