Plasminogen Activator Inhibitor-2 - En Spontant Polymeriserende Serpin i et Præeklampsi Perspektiv
Translated title
Plasminogen Activator Inhibitor-2 - A Spontaneously Polymerising Serpin in a Preeclampsia Perspective
Author
Pedersen, Melissa Fernard Bøg
Term
4. term
Publication year
2021
Abstract
Præeklampsi (svangerskabsforgiftning) rammer cirka 2–5% af alle graviditeter, men årsagen er stadig ukendt. Personer med etableret præeklampsi har lavere niveauer af PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor-2) i blodplasma. Det kan betyde, at PAI-2 spiller en rolle i udviklingen af sygdommen, eller at de lave PAI-2-niveauer er en følge af sygdommen. PAI-2 kan desuden spontant danne polymerer (proteinmolekyler, der klistrer sammen), hvilket kan være relevant i denne sammenhæng. Derfor er der behov for at undersøge PAI-2’s rolle grundigt. Formålet med dette studie var at udvikle eksperimentelle metoder, modeller og værktøjer til at undersøge PAI-2 og dets mulige betydning for præeklampsi. Vi videreudviklede måder at fremkalde polymerisering af PAI-2 og at visualisere, hvor meget polymer der dannes. Derudover genererede og karakteriserede vi monoklonale antistoffer (mAbs) med henblik på at etablere en ELISA-test, der kan kvantificere PAI-2 i plasmaprøver fra gravide. I laboratoriet (in vitro) fremkaldte vi polymerisering af PAI-2 ved kemisk påvirkning med guanidinhydrochlorid (GuHCl) eller ved varme. Prøverne blev analyseret med SDS-PAGE, native PAGE og western blotting (standard metoder, der adskiller og påviser proteiner). Vi karakteriserede muse-mAbs mod PAI-2 og udviklede en ny generation af rotte-mAbs. En ELISA blev opbygget med et muse-mAb som capture-antistof og et polyklonalt antistof (pAb) til detektion, og den blev anvendt på plasma fra patienter med præeklampsi og kontrolpersoner. Vi brugte også magnetiske DynaBeads med et muse-mAb til at opfange PAI-2 fra plasma, som efterfølgende blev vist med western blot. Resultaterne viste, at PAI-2 polymeriserer under både kemisk påvirkning og varme in vitro. I plasmaprøver fra graviditeter fandt vi både intakt (ikke-polymeriseret) og polymeriseret PAI-2. ELISA’en kunne påvise PAI-2 i prøver fra både patienter og kontroller, men metoden kræver fortsat validering. Rotte-mAbs kunne påvise PAI-2 i western blot og binde både intakt og polymeriseret PAI-2 i pladebaserede analyser; ingen af dem var dog specifikke udelukkende for polymeriseret PAI-2. Næste skridt er at validere ELISA’en og at undersøge, om rotte-mAbs genkender naturligt (native) humant PAI-2 i plasma. Fremtidige studier bør afklare, om mængden af PAI-2-polymerer adskiller sig mellem patienter med præeklampsi og ukomplicerede graviditeter.
Preeclampsia affects about 2–5% of pregnancies, and its cause remains unknown. People with established preeclampsia have lower levels of PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor-2) in blood plasma. This could mean that PAI-2 contributes to the condition or that reduced PAI-2 is a consequence of it. PAI-2 can also spontaneously form polymers (protein molecules that stick together), which may be relevant in this context. Therefore, PAI-2’s role needs thorough investigation. The aim of this study was to develop experimental methods, models, and tools to investigate PAI-2 and its potential role in preeclampsia. We refined ways to induce PAI-2 polymerization and to visualize how much polymer forms. We also generated and characterized monoclonal antibodies (mAbs) with the goal of establishing an ELISA test to quantify PAI-2 in plasma from pregnant individuals. In vitro, we induced PAI-2 polymerization chemically using guanidine hydrochloride (GuHCl) or by heat. Samples were analyzed by SDS-PAGE, native PAGE, and western blotting (standard methods that separate and detect proteins). We characterized mouse mAbs against PAI-2 and produced a new generation of rat mAbs. An ELISA was set up with a mouse mAb for capture and a polyclonal antibody (pAb) for detection, and it was applied to plasma from preeclampsia patients and controls. We also used magnetic DynaBeads coated with a mouse mAb to pull down PAI-2 from plasma and visualized it by western blot. Findings showed that PAI-2 polymerized under both chemical and heat induction in vitro. In pregnancy plasma, we detected both intact (non-polymerized) and polymerized PAI-2. The ELISA detected PAI-2 in samples from both patients and controls, but the assay still requires validation. Rat mAbs detected PAI-2 by western blot and bound both intact and polymerized PAI-2 in plate-based assays; however, none was specific only for polymerized PAI-2. Next steps are to validate the ELISA and to assess whether the rat mAbs recognize native human PAI-2 in plasma. Future studies should determine whether the amount of PAI-2 polymers differs between patients with preeclampsia and uncomplicated pregnancies.
[This abstract was generated with the help of AI]
Documents