Investigation of the Antimicrobial Properties of Lipid Transport Proteins from Members of the Brassicaceae Family

Abstract

Det overordnede tema for dette studie er lipid transport-proteiner (LTP’er) fra planter tilhørende Brassicaceae familien. Projektet består at to dele. Den første del af projektet omhandler LTP5 og LTP8 fra A. thaliana, som har usædvanlige LTP pI’er på henholdsvis 11 og 5. 3D modeller af disse proteiner blev konstrueret vha. homologi modellering, og beregning og visualisering af deres elektrostatiske potentialer blev udført. Betydelige forskelle mellem disse blev observeret, hvilket antyder at de to proteiner med meget ens foldninger har forskellige virkningsmekanismer. LTP5 og LTP8 blev forsøgt produceret i forskellige stammer af P. pastoris. En meget lille mængde LTP5 blev detekteret i koncentreret overskydende kultur medie fra et af protein-udtrykningerne, og dette blev vist at det formodede LTP5 havde antimikrobiel aktivitet imod B. subtilis. Generelt var ophobningen af LTP5 og LTP8 i protein-udtrykningerne, som blev udført under forskellige eksperimentelle betingelser, ikke i en detekterbar mængde, og karakterisering af de to proteiner var derfor ikke mulig indenfor tidsrammen. I den anden del af projektet blev protokoller for udtrækning og isolering af formodede LTP’er fra kål udviklet. De udviklede protokoller er anset som anvendelige til isolering af LTP’er fra kål, men betydelige forbedringer mht. udbytte og produktionsmængde blev fundet nødvendige. Det blev konkluderet at tre forskellige medlemmer af LTP 1 familien med forskellig vævsspecificitet blev identificeret og delvist isoleret vha. de udviklede protokoller. Lipid transfer aktivitetsassay blev udført for at bekræfte at proteinerne var ægte LTP’er, men resultaterne heraf forblev tvetydige pga. eksperimentelle usikkerheder. Ingen antimikrobiel aktivitet kunne detekteres imod fire testede mikrober vha. assays med lave koncentrationer af de formodede LTP-fraktioner.

The overall subject of this study is LTPs from members of the Brassicaceae family. The project can be divided in two parts. The first part revolves around LTP5 and LTP8 from A. thaliana, which have unusual LTP pIs of 11 and 5, respectively. 3D models of these two proteins were created by use of homology modeling, and calculation and visualization of their electrostatic potentials were performed. Significant differences were revealed from these, which suggested that these two proteins with very similar folds have different modes of action. LTP5 and LTP8 were attempted to be produced in different strains of P. pastoris. Low amounts of putative LTP5 were detected in concentrated supernatant from one expression study, and was found to have antimicrobial activity against B. subtilis. In general, accumulation of LTP5 and LTP8 was not detectable following the expression studies conducted under different conditions, and characterizations of these proteins were therefore not possible within the time frame. In the second part, selective protocols for extraction and isolation of putative LTPs from cabbage were developed. The developed protocols were considered well-suitable for isolation of LTPs, but needs improvements in terms of yield and through-put. It was concluded that 3 distinct members of the LTP family 1 with different tissue specificities were identified and partly isolated by use of the protocols. Lipid transfer activity assays were performed to verify that the proteins were true LTPs, however, the results remained inconclusive. No antimicrobial activity on four tested microbes could be detected with low concentrations of the putative LTP-fractions.

A master thesis from Aalborg University

Investigation of the Antimicrobial Properties of Lipid Transport Proteins from Members of the Brassicaceae Family

[Undersøgelse af de antimikrobielle egenskaber af lipid transport-proteiner fra medlemmer af Brassicaceae familien]