Extracellular DNA i renkulturer
Translated title
Extracelular DNA in pure cultures
Author
Clemmensen, Rasmus
Term
10. term
Publication year
2009
Pages
68
Abstract
DNA blev længe set som noget, der kun findes inde i celler og lagrer genetisk information. Opdagelsen af ekstracellulært DNA (eDNA) – DNA uden for cellen – har ændret dette syn. eDNA kan blandt andet stabilisere biofilm (tætte bakteriesamfund), beskytte mod fremmed DNA og fungere som næring under sult. Dette speciale undersøger eDNA fra renkulturer af Thermotoga neapolitana, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Tsukamurella spumae og Bacillus mycoides samt fra komplekse prøver fra sten i to forskellige åer. Arbejdet er opdelt i tre dele: 1) forsøg på den termofile bakterie T. neapolitana, 2) forsøg på renkulturer og biofilm af de fire andre bakterier, og 3) forsøg på de komplekse å-prøver. Tilstedeværelsen og udviklingen af eDNA blev bekræftet med både visuelle og genetiske metoder. I renkulturer varierede eDNA-produktionen med kulturens vækstfase og sandsynligvis med forskellige stressfaktorer. eDNA blev forsøgt sammenlignet med genomisk DNA (DNA inde i cellen) ved hjælp af restriktionsenzymerne HaeIII og MspI, som klipper DNA i bestemte mønstre. Disse forsøg var ikke fyldestgørende, fordi det genomiske DNA desværre ikke kunne detekteres, og direkte sammenligning blev derfor umulig. En alternativ tilgang brugte DNase I til at nedbryde eDNA og ethidium monoazide bromid (EMA) til at blokere eDNA, så det eneste DNA, der kunne analyseres, var det genomiske DNA, som blev frigjort, når cellerne blev lyseret (åbnet). Denne metode gav lovende resultater, selvom genomisk DNA ikke kunne amplificeres i alle tilfælde med polymerasekædereaktionen (PCR), en teknik til at kopiere DNA. Genomisk DNA og eDNA blev også sammenlignet ud fra tre housekeeping-gener (16S rRNA, gyrB og rpoB). Ikke alle primere (korte DNA-stykker, der starter PCR) gav de forventede bånd, men generelt var båndene fra eDNA på agarosegeler tydeligere end fra genomisk DNA. Da PCR-produkter fra eDNA indeholdt samme genetiske information som PCR-produkter fra genomisk DNA, tyder resultaterne på, at eDNA i mange tilfælde er en kopi af bakteriernes genomiske DNA.
DNA was long considered to exist only inside cells as a store of genetic information. The discovery of extracellular DNA (eDNA)—DNA outside the cell—has challenged this view. eDNA can help hold biofilms (dense bacterial communities) together, protect against foreign DNA, and serve as a nutrient during starvation. This thesis examines eDNA from pure cultures of Thermotoga neapolitana, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Tsukamurella spumae, and Bacillus mycoides, as well as from complex samples collected from stones in two different streams. The work is organized in three parts: (1) experiments on the thermophilic bacterium T. neapolitana, (2) experiments on pure cultures and biofilms of the other four bacteria, and (3) experiments on the complex stream samples. The presence and development of eDNA were confirmed using both visual and genetic methods. In pure cultures, eDNA production varied with the growth phase and likely with different stress factors. eDNA was first compared to genomic DNA (DNA inside the cell) using the restriction enzymes HaeIII and MspI, which cut DNA into characteristic patterns. These tests were inconclusive because the genomic DNA could not be detected, making direct comparison impossible. An alternative approach used DNase I to degrade eDNA and ethidium monoazide bromide (EMA) to block eDNA, so that only genomic DNA released when cells were lysed (opened) could be analyzed. This method produced promising results, although genomic DNA could not be amplified in all cases using the polymerase chain reaction (PCR), a technique that copies DNA. Genomic DNA and eDNA were also compared by testing for three housekeeping genes (16S rRNA, gyrB, and rpoB). Not all primers (short DNA pieces that initiate PCR) yielded the expected bands, but in general the bands from eDNA on agarose gels were clearer than those from genomic DNA. Because PCR products from eDNA contained the same genetic information as those from genomic DNA, the results suggest that eDNA is often a copy of bacterial genomic DNA.
[This abstract was generated with the help of AI]