Expression and Investigation of RFP-GFP Fusion Protein

Utoft, Rasmus ; Nissen, Michael

4. term

Nanotechnology, Master

2015

2015-09-15

107 pages

I dette kandidat speciale forsøgte vi at konstruere og udtrykke et TagRFP-T-Linker-GFP S65T fusion protein. Dette var forgæves. I stedet blev TagRFP-TagGFP fusion protein genes overført fra pCasper3- GR til en pET11a vector ved hjælp af PCR. pCasper3 blev udtrykt i E. coli BL21(DE3). Fusionsproteinet blev analyseret med SDS-PAGE, fluorescens spektroskopi og absorptions spektroskopi. SDS-PAGE viste at et protein med den rigtige størrelse blev udtrykt. Absorptions spektroskopi viste maksima tæt på dem for TagGFP og TagRFP. Fluorescens spektroskopi viste at FRET var ansvarlig for fluorescensen fra TagRFP når TagGFP blev eksiteret. Temperatur skannings fluorescens spektroskopi blev brugt til at finde smelte temperaturen for TagGFP. Den blev målt til at være 78 ◦. Smeltetemperaturen for TagRFP blev målt til at være mindst 78 ◦. Homologi modellering blev brugt til at finde strukturen af fusionsproteinet. Modelleringen viste at fusionsproteinet bestod af to β-barrels forbundet af en α-helix linker. Afstanden mellem chromoforene blev målt til at være 5 nm. Yderligere studier af linkeren antydede at linkene bestod af en random coil struktur, og at afstanden mellem chromoforene var længere end 5 nm.

In this master’s thesis attempts were made at constructing and expressing a TagRFP-T-Linker-GFP S65T fusion protein. These attempts were unsuccessful. Instead, the TagRFP-TagGFP fusion protein gene was transferred from pCasper3-GR to a pET11a vector using PCR, constructing pCasper3. The pCasper3 was expressed in E. coli BL21 (DE3). The fusion protein was analyzed using SDS-PAGE, fluorescence spectroscopy and absorption spectroscopy. SDS-PAGE showed expression of a correct size protein. Absorption spectroscopy showed maxima close to those of TagGFP and TagRFP. Fluorescence spectroscopy showed that FRET effects were responsible for the TagRFP fluorescence during TagGFP excitation. Temperature scan fluorescence spectroscopy was used to find the melting temperature of TagGFP which was 78 ◦C. The melting temperature of TagRFP was found to be at least 78 ◦C. Homology modelling found that the structure of the fusion protein was two β-barrels connected by an α-helix linker. The distance between the chromophore was found to be 5 nm. Further studies suggested that the linker formed a random coil structure and that the distance between the chromophores was more than 5 nm.

Fluorescent protein ; GFP ; RFP ; FRET ; Master

Download
View record in AAU Student Projects