Characterization of IgE on human effector cells

Abstract

Baggrund: Antallet af diagnosticeret allergiske tilfælde har været stødt stigende i de seneste 60 år med en stadig voksende tendens. Udviklingen medfører, at samfundet kommer til at stå over for en stor sundhedsmæssig udfordring i forhold til de socioøkonomiske omkostninger ved tab af arbejdsstyrke og den nedsatte livskvalitet for de påvirkede individer. Med afsæt i den immunoglobulin E (IgE) medieret reaktion, som skyldes en unormal immunreaktion, bliver der udviklet specifikke IgE antistoffer mod harmløst stimuli. Hovedaktørerne i den allergiske reaktion består af mastceller og de basofile granulocytter, som frigiver biologisk aktive mediatorer, der kan føre til udviklingen af rødme, hævelse, kløe og vejrtrækningsbesvær. Da diagnosen delvis baseres på en påvisning af IgE sensitisering, der er en forudsætning for at individet kan udvikle en allergisk reaktion, så påviser testen ikke nødvendigvis klinisk relevans, derfor er specificiteten af et antistof ikke tilstrækkelig som selvstændig diagnostisk markør, hvorved mere risikable provokationstests bliver udført. Med vægt på personaliseret medicin i allergien er diagnostikken essentiel, men det skaber også et behov for at differentiere imellem patienter for at sikre en højere behandlingseffekt og effektivisere sundedsvæsenets ressourcer. Disse udfordringer leder til formålet af dette specialeprojekt. Formål: Studiet har to primære hovedformål. Det første er at undersøge om en forskel i mastcellereaktivitet og sensitivitet kan findes mellem patienter med svær astma og raske kontroller ved forskellige IgE affiniteter ved brug af mastcelle aktiveringstest (MAT), og om denne påvirker frigivelsen af mediatorer i senfasereaktionen. Det andet hovedformål er at undersøge, om MAT og basofil aktiveringstest (BAT) kan anvendes til at skelne imellem patienter med høj og lav behandlingsrespons på sublingual immunterapi (SLIT). Metode: For at undersøge mastcelleresponsen, blev humane mastceller isoleret fra CD133+ stamceller fra enten GINA 4-5 astmatikere eller raske kontroller. Mastceller var modnet mindst seks uger med cytokinberiget medie. I det første hovedforsøg, blev mastcellerespons med forskellig husstøvmide-specifik rIgE affinitet målt ved at sensitisere mastceller i to uger med høj, mellem og lav-affinitet IgE. Mastcellerne blev aktiveret med rekombinant husstøvmideallergen og målt ved CD63+ opregulering med flowcytometri. I det andet hovedforsøg, blev mastcellerespons med præallergen immunterapi (AIT) sera fra GT-08 studiet eller sera og plasma fra birkeallergikere fra eget regi målt ved at sensitiserere mastceller i to døgn. Mastceller og fuldblods basofile celler blev aktiveret med en relevant sublingual immunterapi (SLIT) tablet og målt ved CD63+ opregulering med flowcytometri. Resultater: Affinitetsbetinget forskel i mastcellereaktivitet og sensitivitet kunne ikke findes mellem patienter og kontroller. Dog kunne der observeres en højere gennemsnitlig reaktivitet(±SE) hos de lav affine patienter på 68.84(±17.11)% end kontrolgruppen p ̊a 40.68(±30.77)%. Effektorcellers præ-AIT reaktivitet og sensitivitet udviste ingen tydelig gruppefordeling i sammenhold med global evaluation scores fra GT-08 studiet. Sammenhæng mellem præ-AIT reaktivitet og sensitivitet ved mastceller og basofile for birkeallergikere og behandlingseffekt af SLIT fandt ingen korrelation. MAT og BAT indikerede lav sammenlignelighed med lav korrelation, men MAT viste høj reproducerbarhed med < ±10% variation i CD63 opregulering og en variation på ±207(μDDE/ml) i sensitivitet. Konklusion: Mastcelle degranulering viser en affinitetsafhængig respons med rIgE ved sensitivitet i hver gruppe, men ingen forskel kunne påvises i mastcelleaktiveringen mellem patienter og raske kontroller. Dog kunne det tyde på, at astmatikere reagerer kraftigere under reduceret stimulus end kontroller, men dette bør udforskes yderligere. MAT lavet med buffy-coats og passiv sensitisering med serum og plasma er reproducerbar. Mastcellerespons fra præ-AIT IgE havde ingen prædiktiv værdi som biomarker for effekten af AIT. BAT respons og rollen som prædiktiv biomarkør for effekten af AIT er inkonklusiv og bør efterforskes mere.

Background: The number of individuals diagnosed with allergic diseases have been steadily increasing throughout the last 60 years - with a still rising trend. The high amount of allergic cases will ultimately lead to huge socioeconomic costs for the public due to loss of productivity and decreased life quality of the affected individuals. With focus on the immunoglobulin E (IgE)-mediated reaction, which is caused by an abnormal immune response to harmless substances in the environment, specific IgE (sIgE) is developed. The interaction of sIgE with the main effector cells of allergy, mast cells and basophils, lead to the release of several biological active mediators, resulting in the development erythema, edema, pruritus and dyspnea. As the diagnosis is partially based on the detection of sIgE sensitization, which is a prerequisite for the development of an allergic reaction, it is not always clinically relevant. Thus, sIgE is not a sucient diagnostic marker, in which the need for more hazardous provocation challenges is performed. In a field with focus on personalized medicine, accuracy is important for diagnostics, however the need to discriminate between patients is also a cornerstone to obtain higher treatment effects and to streamline the resources of the health care system. The challenges described above have led to the objectives of this master thesis. Aim: This project has two main objectives. The first aim is to investigate whether a difference in mast cell reactivity and sensitivity can be established between patients with severe allergic asthma and healthy controls at different affinities of IgE using mast cell activation test (MAT), and whether this affects the release of mediators during the late phase response. The second aim is to investigate, whether MAT and basophil activation test (BAT) can be used to characterize and discriminate high from low sublingual immunotherapy (SLIT) treatment responders. Methods: To investigate mast cell response, human mast cells were isolated from CD133+ progenitor cells from either GINA 4-5 asthmatics or healthy controls. Mast cells were matured at least six weeks with cytokine-enriched media. Mast cell response with different house dust mite-specific rIgE affinity was measured by CD63+ upregulation with flow cytometry. Mast cell response with pre-AIT sera from the GT-08 study or sera and plasma from in-house birch allergic individuals was measured by sensitising mast cells over two days. Mast cells and full-blood basophils were activated with a SLIT tablet and measured by CD63+ upregulation with flow cytometry. Results: An affinity dependent difference in mast cell reactivity and sensitivity could not be established between the patient- and control group. However, an increased mean reactivity(±SE), in the mast cells sensitized with low affinity IgE, was observed for the patient group 68.84(±17.11)% com- pared to the control group 40.68(±30.77)%. Neither the baseline reactivity nor sensitivity showed any clear groupings with the global evaluation scores from the GT-08 study. Correlation was found between baseline reactivity and sensitivity for individuals suffering from birch pollen allergy, whilst no correlation was found for treatment effect. MAT and BAT indicated low comparability and poor correlation, but MAT indicated high reproducibility with <10%CD63 expression variation and a variation of 207(μDDE/ml) in sensitivity. Conclusion: Mast cell degranulation demonstrated an affinity dependent response with rIgE in sensitivity within groups, but no difference in CD63 upregulation could be established between patient- and control derived mast cells. The low affinity sensitized mast cells might indicate that asthmatics respond stronger to a reduced stimulus, but further research is needed. MAT performed with buffy coats, which have been sensitized with either serum or plasma, has proven to be reproducible. Mast cell response from pre-AIT treatment could not be established as a predictive biomarker for AIT treatment. The BAT response and its role as a predictive biomarker for AIT was inconclusive and require further research.

A master thesis from Aalborg University

Characterization of IgE on human effector cells

[Karakterisering af IgE på humane effektor celler]