Analyse af geners ekspressionsprofil i arkiveret lymfoidt materiale: Undersøgelse af metode til kvalitetsbaseret udvælgelse af tumorvæv, der er fikseret i formalin og indstøbt i paraffin
Oversat titel
Gene expression profiling on archived lymphoma material: Establishment of a reliable method for quality based selection of formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue
Forfatter
Elung-Jensen, Sara
Semester
7. semester
Udgivelsesår
2008
Antal sider
77
Abstract
Dette projekt undersøger, om længere inkubation med enzymet proteinase K kan forbedre oprensning af RNA fra tumorvæv, der er konserveret som FFPE (fikseret i formalin og indstøbt i paraffin). RNA af høj kvalitet er vigtigt for efterfølgende genekspressionsanalyser, for eksempel på DNA-chips (mikroarrays). To kommercielle oprensningskits (Qiagen RNeasy FFPE Kit og MasterPure RNA Purification Kit) blev testet med ændringer i proteinase K-trinnet. Kvalitet og mængde af RNA blev vurderet med NanoDrop, Agilent Bioanalyzer, real-time kvantitativ PCR og DNA-chip. Resultaterne viste, at længere inkubation med proteinase K gav RNA af højere kvalitet. Derudover klarede Qiagens RNeasy FFPE Kit sig bedre til FFPE-væv, og der var behov for en ekstra DNase I-behandling for at fjerne resterende DNA. For at afprøve en metode til kvalitetsbaseret udvælgelse af tumorvæv til genekspressionsanalyse blev et 3’/5’-forhold beregnet ved hjælp af kvantitativ PCR med GAPDH som endogen kontrol (referencegen). Analyse af fem tilfældige FFPE-prøver viste, at der var meget få RNA-fragmenter længere end 800 nukleotider, og at i gennemsnit kun ét ud af 100 RNA-fragmenter var 300 nukleotider eller længere. Samlet peger resultaterne på, at længere proteinase K-inkubering og efterfølgende DNase-behandling kan forbedre RNA-kvaliteten fra FFPE-prøver, men at RNA fra sådanne prøver ofte er stærkt fragmenteret.
This project examines whether longer incubation with the enzyme proteinase K can improve the purification of RNA from tumor tissue preserved as FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded). High-quality RNA is essential for downstream gene expression analyses, such as on DNA chips (microarrays). Two commercial purification kits (Qiagen RNeasy FFPE Kit and the MasterPure RNA Purification Kit) were tested by modifying the proteinase K step. RNA quantity and quality were assessed using a NanoDrop, an Agilent Bioanalyzer, real-time quantitative PCR, and a DNA chip. The results showed that extended proteinase K incubation produced higher-quality RNA. Qiagen’s RNeasy FFPE Kit performed better for FFPE tissue, and an additional DNase I treatment was needed to remove residual DNA. To explore a quality-based way to select tumor samples suitable for gene expression analysis, a 3’/5’ ratio was calculated using quantitative PCR with GAPDH as an endogenous control (reference gene). Analysis of five random FFPE samples showed very few RNA fragments longer than 800 nucleotides, and on average only one out of 100 RNA fragments was 300 nucleotides or longer. Overall, the findings indicate that longer proteinase K incubation and follow-up DNase treatment can improve RNA quality from FFPE samples, but RNA from such material is often highly fragmented.
[Dette resumé er genereret ved hjælp af AI]